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Cdc42 Activation Assay Kit

價格¥6800.00
品牌NewEastBio   
產地美國
貨號80701
免疫原小鼠
規格20Test
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  • 概述

    Configuration-specific Monoclonal Antibody Based 

    Cdc42 Activation Assay Kit 

    Catalog Number:80701 

    20 assay


    產品說明

           小G蛋白是從屬于細胞調節因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族,它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種, Cdc42參與生理活動過程中其分子結構會呈現出2種相互轉換的形式:與GTP結合的激活狀態和與GDP結合的非活性狀態。

           目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶(PAK)的p21結合區域(PBD)結合,使PAK活化從而發揮生物學功能,進而間接的進行Cdc42活性功能的監測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結合蛋白與p21結合區域之間較低的親和力,導致這種檢測方法的重復性較差。

            紐斯特生物技術有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據單克隆抗體能夠特異性的識別Cdc42-GTP結合蛋白,而不識別Cdc42-GDP結合蛋白,進而簡單并且快速的進行Cdc42的活性檢測。同時試劑盒中的Cdc42-GTP單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Cdc42的活性監測。每套試劑盒可以進行20次檢測。


    檢測原理

         武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異形態的Cdc42-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的(樣品需要進行GTPγS活化處理)活性Cdc42-GTP的水平。簡言之,特異性識別Cdc42活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白,然后利用protein A/G將抗原抗體的結合物吸附下來,再利用特異性識別Cdc42活化構象的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。


    試劑盒成分

    1. 特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克隆抗體(Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)):小管裝--30ul (抗體濃度是1mg/ml),抗體溶于PBS(pH7.4)并包含50%的甘油和0.05%的疊氮化鈉。此抗體可以特異性識別所有脊椎動物中的Cdc42-GTP。

    2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) :小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。(使用時溶液需要充分混勻,再吸?。?/p>

    3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303):小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

    4. 特異性識別Cdc42活性構象的兔多克隆抗體(Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)):小管裝--30ul (抗體濃度是1mg/ml),抗體溶于PBS(pH 7.4)并包含有   50%的甘油。

    5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) :小管裝—100ul (10 mM) ,實驗中0.5mL細胞裂解液使用      5ul GTPγS標記。

    6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) :小管裝—100ul (100 mM) ,實驗中0.5mL細胞裂解液使用5ul GDP標記。


    儲存條件

    試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內必須存放于4°C條件下保存。

    試劑(試劑盒內不提供,由實驗者自行配置)

    1.  刺激和未刺激的細胞裂解物;

    2.  蛋白酶抑制劑;

    3.  4 °C 搖桿或者搖床;

    4.  0.5 M EDTA (pH 8.0);

    5.  1 M MgCl2;

    6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer;

    7.  電泳和免疫印跡相關試劑;

    8.  免疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

    Tween-20);

    9.  免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA);

    10. PVDF或硝酸纖維素膜;

    11.  二抗;

    12.  ECL 檢測試劑;


    試劑制備

    1X Assay/Lysis Buffer:實驗前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液,并在使用前加入蛋白酶抑制劑如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 μg/mL aprotinin(抑肽酶)。


    樣品處理

    貼壁細胞

    1. 培養細胞密度達到大約80%-90%之間(直徑10 cm培養皿,~107個細胞),并用活性劑或抑制劑進行處理。

    2. 吸去培養基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

    3. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液(每個直徑10cm的組織培養皿中加入0.5-1mL)。

    4. 將培養皿放置于冰上處理10-20分鐘。

    5. 用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

    6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

    7. 如果核發生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時,將細胞裂解物用27?的注射器針頭來回吸取3-4次,以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現。

    8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

    懸浮細胞

    1. 培養細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

    2. 計數細胞后離心。

    3. 吸去培養基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

    4. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液(每個直徑10cm的組織培養皿中加入0.5-1mL)。

    5. 反復吹打細胞進行裂解。

    6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

    7. 如果核發生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時,將細胞裂解物用27?的注射器針頭來回吸取3-4次,以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現。

    8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。


    體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對照

    注意:在細胞體內環境條件下大約有10%的Cdc42被激活,而在體外用GTPγS處理大約有90%的Cdc42被激活。

    1. 準備兩個離心管,每個管中各加入0.5 mL的細胞提取物(如果是純的Cdc42蛋白則每個管中加入的蛋白量為1ug)。

    2. 每個管中加入20ul 0.5M EDTA(終濃度即為20 mM)。

    3. 一個管中加入5ul的100X GTPγS(終濃度即為100 uM)作為陽性對照。另一個管中加入5ul的100X GDP(終濃度即為1 mM)作為陰性對照。

    4. 將離心管置于30°C條件下反應30min并不斷攪動。

    5. 終止反應:將管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為60mM)。


    檢測步驟

    Ι?;钚訡dc42 Pull-Down實驗

    1. 等分0.5-1 mL的細胞裂解物至微量離心管中。

    2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 緩沖液。

    3. 向管中加入1ul的活性Cdc42單克隆抗體。

    4. 用渦旋振蕩儀將protein A/G凝膠柱充分混勻,然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

    5. 將管置于4°C條件下孵育1H,并輕輕的進行搖動。

    6. 5000g,離心1分鐘。

    7. 棄上清,這一步要非常小心以避免珠子的損失。

    8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis緩沖液洗滌珠子三次,離心并棄去上清。

    9. 最后一次洗滌后,小心的移去所有的上清。

    10. 用20ul的2X SDS-PAGE樣品緩沖液重懸樣品。

    11. 樣品煮沸5min。

    12. 5000g,離心10s。

    II. 電泳和轉膜

    1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

    2. 按照制造商的說明進行SDS-PAGE。

    3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到PVDF或硝化纖維素膜。

    III.免疫印跡反應和檢測(所有步驟都是在室溫下進行,并不斷攪拌)

    1. 將PVDF膜浸入100%甲醇15s,然后在室溫放置5 min晾干。

    注意:如果使用的是硝化纖維素膜,此步省略。

    2. 封閉:用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進行封閉,并需要恒定振蕩。

    3. 孵育一抗:用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識別Cdc42活性構象的兔多克隆抗體(稀釋比例為1:50-1:1000,主要根據樣品中含有的Cdc42蛋白的量),室溫下孵育1-2小時,或者4°C條件下過夜孵育。

    4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

    5. 孵育二抗:(例如羊抗兔IgG-HRP),用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用,室溫下孵育1小時并恒定振蕩。

    6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

    7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如ECL顯色法。

      

    示例結果

    下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考。

     QQ截圖20191115102102.png

    Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)用表皮細胞因子(EGF)處理(Lane 2)和未處理(Lane 1)。細胞裂解物用特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)?;钚訡dc42珠子顆粒用特異性識別Cdc42活性構象的兔多克隆抗體(Cat # 21010)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實驗結果。(底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。)


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    Publications:
    1.  Vibrio parahaemolyticus Effector Proteins Suppress Inflammasome Activation by Interfering with Host Autophagy Signaling
        PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003142
    2.  Interferon gamma induces actin polymerization, Rac1 activation and down regulates phagocytosis in human monocytic cells
        Cytokine. 2012 Jan;57(1):158-68
    3.  Invadopodia and rolling-type motility are specific features of highly invasive p190bcr-abl leukemic cells
        European Journal of Cell Biology Volume 91, Issues 11–12, November–December 2012, Pages 978–987
    4.  Epithelial junction formation requires confinement of Cdc42 activity by a novel SH3BP1 complex
        J Cell Biol. 2012 Aug 20;198(4):677-93
    5.  Polarized migration of lymphatic endothelial cells is critically dependent on podoplanin regulation of Cdc42
        Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2011 Jan;300(1):L32-42
    6.  The Aarskog-Scott Syndrome Protein Fgd1 Regulates Podosome Formation and Extracellular Matrix Remodeling in Transforming Growth Factor beta-Stimulated Aortic Endothelial Cells
        Mol Cell Biol. 2011 Nov;31(22):4430-41
    7.  MMP-9 and CXCL8/IL-8 Are Potential Therapeutic Targets in Epidermolysis Bullosa Simplex
        PLoS One. 2013 Jul 19;8(7):e70123
    8.  p21-Activated Kinase (PAK) Regulates Cytoskeletal Reorganization and Directional Migration in Human Neutrophils
        PLoS One. 2013 Sep 3;8(9):e73063
    9.  The Cdc42 Guanine Nucleotide Exchange Factor FGD6 Coordinates Cell Polarity and Endosomal Membrane Recycling in Osteoclasts
        J Biol Chem. 2014 Jun 27;289(26):18347-59
    10.  Cdc42 Inhibitor and Uses Thereof
        United States Patent Application 20140194451
    11.  The α4 Nicotinic Receptor Promotes CD4+ T-Cell Proliferation and a Helper T-Cell Immune Response
        Molecular Pharmacology January 2014 vol. 85 no. 1 50-61




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