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抗體常見問題之WB


問題原因解決方案
條帶形狀不好看膠凝的不均勻,聚合不好灌膠前將溶液充分混勻
上樣齒扭曲使上樣孔大小不一上樣前用針頭將齒撥正,注意不要將針頭插入膠內
某些樣品鹽濃度較高除鹽或將樣品鹽濃度調成一致
每孔上樣量不一致調整上樣量使基本一致
緩沖液陳舊,成分改變重配
凝膠下面有氣泡電泳前先將氣泡趕走
電泳時溫度過高降低電流或電壓
目的蛋白信號弱樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低加大上樣量或濃縮樣品
轉膜效率低以下單列
抗體濃度低增加抗體濃度或延長孵育時間
顯色劑底物濃度不足增加顯色劑用量
顯色劑失效更換顯色劑(吸取A、B液的槍頭不可混用)
顯色或曝光時間不足延長顯色或曝光時間
轉膜效率低轉膜緩沖液pH值與目的蛋白等電點相近提高轉膜緩沖液pH值
凝膠與膜之間存在氣泡轉膜前要排盡氣泡
凝膠與轉印膜兩側濾紙大面積接觸濾紙、轉印膜和凝膠大小要基本一致,避免濾紙直接接觸
轉印膜種類選擇不當使用質量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜
電壓或電流過小濕轉時20mA恒流,半干轉時25V左右恒壓
轉印時間過長或過短,蛋白還在凝膠中或穿透轉印膜先電泳,根據蛋白大小及轉印裝置選擇合適的轉印時間
濕轉過程中環境溫度過高使用預冷的轉膜緩沖液或將裝置至于4度
顯色或曝光后無條帶膠與膜方向反了

轉膜時應依次放好PDVF膜與凝膠所對應的電極,即凝膠對應

負極,PDVF膜對應正極。

選用的一抗、二抗及顯色方法不合適選擇合適的一抗、二抗和顯色方法
目的蛋白含量低于檢測下限加大上樣量或濃縮樣品
抗體效價過低增加抗體濃度
抗體孵育時間不足延長孵育時間,37°C孵育1小時以上
抗體過度洗滌減少洗滌時間及次數
加入HRP底物反應與曝光檢測之間間隔時間過長反應3到5分鐘及時檢測
背景過高封閉物用量不足提高封閉物濃度,孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜
封閉物使用不當檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉
封閉時間不夠室溫37度封閉1小時以上,4度封閉過夜
抗體非特異性結合降低抗體濃度,減少孵育時間
抗體濃度過高或洗滌不夠降低抗體濃度,增加洗滌次數和時間
化學顯色底物過多按說明書加入適量的顯色底物
雜帶多雜蛋白多處理目的蛋白
抗體特異性不強使用特異性強的抗體
抗體孵育時間過久減少抗體孵育時間
二抗與抗原有交叉反應選擇合適的封閉物
底物顯色與曝光時間長了縮短顯色及曝光的時間
大分子量WB膜孔徑太小更換孔徑較大的膜
轉膜電壓電流低提高電壓/電流
轉膜時間短延長轉膜時間
膠濃度太大使用低濃度的膠
轉膜緩沖液配方不合適調整轉膜緩沖液中甲醇及SDS濃度


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